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在一項新的研究中，來自丹麥技術大學、美國勞倫斯伯克利國家實驗室、加州大學伯克利分校和中國科學院深圳先進技術研究院的研究人員開發(fā)出一種基于CRISPR/Cas9的方法，從而能夠靈活地對必需的酶和非必需的酶進行基因改造。這有很多應用，包括開發(fā)產(chǎn)生基于生物的藥物、食品添加劑、燃料和化妝品的方法。相關研究結果發(fā)表在2018年7月的Metabolic Engineering期刊上，論文標題為“CasPER, a method for directed evolution in genomic contexts using mutagenesis and CRISPR/Cas9”。
 

圖片來自The Novo Nordisk Foundation Center for Biosustainability, DTU。

丹麥技術大學諾和諾德基金會生物可持續(xù)發(fā)展中心研究員Tadas Jakociunas說，“當有生產(chǎn)菌株時，這將使得更容易對生物合成通路中的某些限制酶進行基因改造，提高它們的效率、特異性或多樣性。人們將能夠發(fā)現(xiàn)這個通路中的酶變體，這會增加有價值的化合物的產(chǎn)量。”

這種新開發(fā)的方法稱為CasPER，并且是基于CRISPR/Cas9等現(xiàn)有技術構建出來的，其中，CRISPR/Cas9近年來已用于酵母中的基因組改造和重編程。然而，這種新的工具能夠讓科學家們通過整合更長的多樣化片段來對酶或它們的活性結構域進行基因改造，從而提供了靶向特定基因組區(qū)域中的每個堿基的機會。在酵母中，CasPER能夠以幾乎100％的效率整合發(fā)生突變的DNA片段，甚至能夠以多重的方式進行整合。

發(fā)現(xiàn)酶變體

通過對這種新方法進行深入分析，這些研究人員得出結論：與現(xiàn)存的CRISPR/Cas9方法之間的主要差別在于CasPER允許地和以多重的方式整合攜帶著多種突變的大片段DNA，從而產(chǎn)生具有數(shù)十萬種酶變體的細胞庫。

盡管其他的CRISPR方法主要依賴于整合較短的序列而讓DNA多樣化，而且這需要多輪基因改造，但是CasPER顯著拓寬了接受基因改造的DNA片段的長度。此外，它不需要任何額外的步驟，這使得更快和更有效地讓酶多樣化，從而產(chǎn)生更高產(chǎn)量的所需化學物。

篩選平臺

比如，在引入CRISPR/Cas9之前，對酵母中的必需酶進行基因改造是一個相當緩慢的過程。如今，對酶進行更加和特異性的基因改造是可行的，這就允許它們將更多的底物轉化為產(chǎn)物。

Jakociunas說，“構建用于產(chǎn)生有價值化合物的細胞工廠仍然是非常昂貴和耗時的，因此將所有這些資金和時間投入在基因改造上需要得到回報。你需要生產(chǎn)一定數(shù)量的產(chǎn)品以讓它具有商業(yè)相關性，而且像CasPER這樣的工具肯定有助于加速和放大這個過程。”

作為這項研究的概念驗證，這些研究人員靶向了甲羥戊酸途徑（mevalonate pathway）中的幾種必需的酶。這種生物合成途徑負責甾醇的產(chǎn)生，并且在大多數(shù)有機體中是必需的。從對人類的研究來看，它因是他汀類藥物的靶標而廣為人所知，其中他汀類藥物是一類降膽固醇藥物。這類藥物通過抑制該途徑中的一些步驟而發(fā)揮作用。在一些細菌和真核生物中，該途徑負責產(chǎn)生大的一類化合物---類異戊二烯（isoprenoid）。為了證實CasPER的適用性和效率，他們靶向了甲羥戊酸途徑中的兩種必需酶，并且能夠構建細胞工廠，從而將類胡蘿卜素的產(chǎn)量增加了11倍。

行業(yè)和學術界的巨大潛力

在未來，CasPER能夠廣泛用于學術界和行業(yè)。盡管這種方法的主要應用是加速設計和優(yōu)化細胞工廠，并降低這種設計和優(yōu)化的成本，但是它也能夠應用于需要DNA多樣化的任何實驗。

Jakociunas說，“你能夠研究蛋白功能以便開發(fā)蛋白結構預測工具，以及研究蛋白與DNA、底物和其他分子之間的相互作用以便讓啟動子、終止子和增強子之類的調(diào)控元件多樣化。”

這種方法在酵母中得到驗證，但是它也能夠用于其他的具有的同源重組機制的有機體。（生物谷 ）

參考資料：

TadasJako?iūnasa, Lasse E.Pedersena, Alicia V.Lis et al. CasPER, a method for directed evolution in genomic contexts using mutagenesis and CRISPR/Cas9. Metabolic Engineering, July 2018, 48:288-296, doi:10.1016/j.ymben.2018.07.001.